Metodo ELISA Sandwich: Principi, Applicazioni e Interpretazione

L'Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), o saggio immuno-assorbente legato ad un enzima, rappresenta una pietra miliare nelle tecniche di analisi immunologica. La sua versatilità e sensibilità lo rendono uno strumento cruciale in diversi ambiti, dalla diagnostica clinica alla ricerca scientifica. Questo articolo esplora in dettaglio cos'è l'ELISA, come funziona, quando è appropriato eseguirlo e le sue diverse applicazioni, offrendo una panoramica completa sia per i neofiti che per i professionisti del settore.

Cos'è l'ELISA? Una Definizione Approfondita

ELISA è una tecnica biochimica che permette di rilevare e quantificare la presenza di una specifica sostanza, solitamente un antigene o un anticorpo, in un campione biologico. La sua specificità deriva dall'utilizzo di anticorpi, molecole proteiche prodotte dal sistema immunitario in risposta a un antigene. Questi anticorpi si legano all'antigene bersaglio con elevata affinità, formando un complesso che può essere rilevato e quantificato. La "enzima-linked" (legato ad un enzima) si riferisce al fatto che uno degli anticorpi utilizzati nel test è legato ad un enzima. Questo enzima catalizza una reazione che produce un cambiamento di colore, la cui intensità è proporzionale alla quantità di antigene o anticorpo presente nel campione. In sostanza, l'ELISA trasforma un'interazione biologica in un segnale misurabile, consentendo un'analisi quantitativa precisa.

Prima del suo sviluppo, l’unica opzione per condurre un saggio immunologico era riconducibile ad una tecnica che utilizza antigeni o anticorpi marcati radioattivamente. Poiché la radioattività pone una potenziale minaccia per la salute, il test ELISA ha rappresentato un’alternativa più sicura.

Principi delle tecniche immunochimiche

L’immunochimica è una disciplina immunologica che si prefigge di studiare gli antigeni, gli anticorpi e l’interazione antigene-anticorpo. L’antigene è quella sostanza che, in opportune condizioni, è in grado di indurre la formazione di uno o più anticorpi, reagendo specificatamente con questi. D’altra parte, gli anticorpi sono sostanze di natura glicoproteica definiti anche come immunoglobuline o gamma globuline. La produzione di anticorpi si ottiene per differenziazione delle plasmacellule a seguito dell’azione della risposta immunitaria.

L’interazione che si instaura tra antigene e corrispondete anticorpo porta alla formazione di quello che viene definito come immunocomplesso (la natura del legame è di tipo non covalente e reversibile). L’analita o gli anticorpi, sono marcati con una sostanza definita tracciante che permette il rilevamento e può essere un radioisotopo, un composto fluorescente o un enzima.

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La specificità delle reazioni antigene-anticorpo e la sensibilità dei “marcatori” possono essere combinate insieme per compiere un “dosaggio immunologico”, ossia quantificare con precisione una sostanza antigenica. La tecnica più usata è il dosaggio radioimmunologico (RIA), in cui il tracciante è costituito da un isotopo. Quando, invece, il tracciante è costituito da un enzima, si parla di dosaggi immunoenzimatici (EIA).

Traccianti più comuni per la rilevazione del complesso antigene-anticorpo

Nell’immunochimica sono diversi gli enzimi utilizzabili come traccianti. Tra i più noti ritroviamo la perossidasi (HRP), una molecola classificata nel gruppo delle ossido reduttasi: si estrae dalla radice delle piante di rafano (Cochlearia armoracia) e svolge attività antiossidante, contribuendo a preservare le cellule e i tessuti dagli effetti dannosi delle sostanze prodotte dall’attività ossidasica in vivo. La perossidasi agisce, quindi, da catalizzatore di una reazione di ossido-riduzione, nella quale un substrato rilascia elettroni che ossidano un cromogeno.

Un secondo importante tracciante è la fosfatasi alcalina (nell’isoforma estratta dall’intestino di bue). La colorazione si sviluppa in seguito all’idrolisi enzimatica degli esteri che costituisco il substrato, che si scindono in composti fenolici e fosfati. A questo punto, i composti fenolici si uniscono con il cromogeno per formare il prodotto colorato.

L’immunodosaggio può essere rilevato anche grazie al complesso avidina-biotina. L’avidina è una proteina presente nel bianco dell’uovo, in grado di legare con alta affinità la biotina. Quest’ultima, può coniugarsi ad altre proteine senza alterare le loro caratteristiche e mantenendo inalterata la sua affinità per l’avidina. Quindi, queste proprietà sono fruttante per la rilevazione colorimetrica del complesso antigene-anticorpo, dove è molto importante preservare l’integrità del legame per avere un’alta sensibilità e specificità della reazione.

Come Funziona l'ELISA: Una Guida Passo Passo

Sebbene esistano diverse varianti dell'ELISA, il principio di base rimane lo stesso. Ecco una descrizione dettagliata dei passaggi fondamentali:

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1. Rivestimento (Coating): Il primo passo consiste nel rivestire una piastra di microtitolazione (solitamente a 96 pozzetti) con l'antigene bersaglio (se si vuole rilevare la presenza di anticorpi) o con l'anticorpo di cattura (se si vuole rilevare la presenza di un antigene). L'antigene o l'anticorpo si adsorbe passivamente sulla superficie del pozzetto.
2. Blocco (Blocking): Dopo il rivestimento, i pozzetti vengono bloccati con una soluzione proteica (ad esempio, albumina sierica bovina o BSA) per saturare i siti di legame liberi sulla piastra e prevenire legami non specifici degli anticorpi successivi.
3. Incubazione con il Campione: Il campione biologico (ad esempio, siero, plasma, o liquido cerebrospinale) viene incubato nei pozzetti. Se il campione contiene l'analita bersaglio (l'antigene o l'anticorpo che si sta cercando), questo si legherà all'antigene o all'anticorpo di cattura presente sulla piastra.
4. Incubazione con l'Anticorpo di Rilevazione: Dopo aver lavato via il materiale non legato, viene aggiunto un anticorpo di rilevazione specifico per l'analita bersaglio. Questo anticorpo è coniugato con un enzima (ad esempio, perossidasi di rafano o fosfatasi alcalina).
5. Incubazione con il Substrato: Dopo un ulteriore lavaggio, viene aggiunto un substrato specifico per l'enzima coniugato all'anticorpo di rilevazione. L'enzima catalizza la reazione del substrato, producendo un cambiamento di colore.
6. Lettura: L'intensità del colore viene misurata con uno spettrofotometro a micropiastre. L'assorbanza, ovvero la quantità di luce assorbita, è direttamente proporzionale alla quantità di analita presente nel campione.

Tipi di ELISA

Esistono diverse varianti dell'ELISA, ognuna con specifiche caratteristiche e applicazioni. Le principali sono:

• ELISA Diretto: L'antigene viene direttamente legato alla piastra e l'anticorpo di rilevazione, coniugato con l'enzima, si lega direttamente all'antigene. È la forma più semplice, ma meno sensibile.
• ELISA Indiretto: L'antigene viene legato alla piastra, quindi viene aggiunto un anticorpo primario che si lega all'antigene. Successivamente, viene aggiunto un anticorpo secondario, coniugato con l'enzima, che si lega all'anticorpo primario. Questo aumenta la sensibilità rispetto all'ELISA diretto.
• ELISA a Sandwich: Un anticorpo di cattura viene legato alla piastra. L'antigene si lega all'anticorpo di cattura. Successivamente, viene aggiunto un anticorpo di rilevazione, anch'esso specifico per l'antigene, che si lega all'antigene. Questo metodo è molto specifico e sensibile, ideale per la rilevazione di antigeni complessi.
• ELISA Competitivo: L'antigene nel campione compete con un antigene coniugato con l'enzima per il legame con un anticorpo. Maggiore è la quantità di antigene nel campione, minore sarà il segnale. Questo metodo è utile quando l'antigene è piccolo e non può essere facilmente legato alla piastra.

Saggio ELISA: ELISA diretto o a “sandwich”

Nel test ELISA diretto, l’antigene è adeso alla base del supporto solido e la sua presenza può essere rilevata attraverso l’utilizzo di un anticorpo marcato con un enzima che, se fatto reagire con un opportuno substrato, permette l’osservazione di un complesso (prima incolore) che adesso produrrà una colorazione apprezzabile.

Analizzando più da vicino il metodo diretto a sandwich, per determinare la presenza di un determinato antigene in un campione biologico, è necessario seguire delle fasi consequenziali:

1. Fissaggio al substrato dell’anticorpo primario specifico per l’antigene da ricercare;
2. Lavaggio per eliminare l’eccesso di anticorpo;
3. Aggiunta del campione da saggiare per la presenza o meno dell’antigene;
4. Lavaggio per togliere antigeni in eccesso;
5. Aggiunta di un anticorpo secondario specifico per l’antigene coniugato a un enzima specifico (perossidasi o fosfatasi alcalina). Se l’antigene è presente l’anticorpo si legherà selettivamente al complesso anticorpo-antigene, formando un triplo strato da cui prende il nome il test;
6. Lavaggio con soluzione tampone dell’eccesso;
7. Aggiunta del substrato per l’enzima coniugato all’anticorpo che porterà alla formazione di un prodotto colorato;

In linea generale, lo sviluppo del colore è indicativo della presenza dell’antigene che si voleva saggiare e l’intensità della colorazione è semi-quantitativa e misurabile attraverso l’uso dello spettrofotometro.

ELISA indiretto

La procedura implica l’uso di un anticorpo secondario marcato che sia in grado di riconoscere la regione costante dell’anticorpo primario, precedentemente incubato in fase solida. In questa metodica, a differenza delle precedenti descritte, è importante determinare la presenza di un determinato anticorpo.

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I passaggi sono i seguenti:

1. Fissaggio al substrato dell’antigene specifico per l’anticorpo che vogliamo misurare;
2. Lavaggio per eliminare l’eccesso di antigene;
3. Aggiunta del siero (campione) che si vuole saggiare per ricercare la presenza di anticorpi;
4. Lavaggio per eliminare l’eccesso di anticorpi che non hanno legato l’antigene;
5. Aggiunta di un anti-anticorpo, cioè un anticorpo secondario marcato con un enzima che legherà, se presenti, gli anticorpi nel campione;
6. Lavaggio per eliminare eventuali anticorpi non legati al complesso;
7. Aggiunta del substrato dell’enzima con marcato l’anti-anticorpo: un cambiamento di colore indica la presenza degli anticorpi nel siero (campione), visto che l’enzima agisce sul substrato modificandolo, in maniera che assorba la luce e risulti colorato;

Quando Fare l'Esame ELISA: Indicazioni Cliniche e Diagnostiche

L'esame ELISA è ampiamente utilizzato in diversi contesti clinici e diagnostici. Alcune delle principali applicazioni includono:

• Diagnosi di Malattie Infettive: L'ELISA è uno strumento fondamentale per la diagnosi di numerose malattie infettive, sia virali che batteriche. Permette di rilevare la presenza di anticorpi specifici nel siero del paziente, indicando un'infezione pregressa o in corso. Esempi comuni includono la diagnosi di HIV, epatite (A, B, e C), virus Zika, malattia di Lyme, toxoplasmosi e rosolia.
• Allergie: L'ELISA può essere utilizzato per misurare i livelli di IgE specifiche per determinati allergeni, aiutando a identificare le cause di reazioni allergiche.
• Malattie Autoimmuni: L'ELISA è utile per rilevare autoanticorpi, ovvero anticorpi diretti contro i propri tessuti, che sono caratteristici di molte malattie autoimmuni come il lupus eritematoso sistemico (LES), l'artrite reumatoide e la tiroidite di Hashimoto.
• Oncologia: L'ELISA può essere utilizzato per rilevare marcatori tumorali nel sangue, contribuendo alla diagnosi precoce e al monitoraggio della risposta al trattamento in alcuni tipi di cancro.
• Monitoraggio di Farmaci: L'ELISA può essere utilizzato per misurare i livelli di farmaci nel sangue, assicurando che i pazienti ricevano la dose corretta e minimizzando il rischio di effetti collaterali.
• Ricerca Scientifica: L'ELISA è uno strumento essenziale nella ricerca biomedica per la quantificazione di proteine, ormoni, citochine e altri biomarcatori in diversi campioni biologici.

Esempi applicativi

La tecnica ELISA ha numerose applicazioni che spaziano dalla diagnostica alla rilevazione delle intolleranze alimentari. Nel caso dell’intolleranza alimentare (mediata da immunoglobuline IgG) e dell’allergia alimentare (mediata da immunoglubuline IgE), il test può essere effettuato con un semplice prelievo di sangue capillare, anche presso le farmacie.

ELISA ha sicuramente destato attenzione per la sua capacità di verificare l’eventuale esposizione ad un determinato agente patogeno: ne è un esempio conclamato il test HIV-Ab utilizzato per diagnosticare l’eventuale presenza di anticorpi anti-HIV.

Inoltre, come non citare i test sierologici rivolti all’identificazione dell’infezione da nuovo coronavirus di cui tanto si sente parlare. Col crescere degli individui contagiati, infatti, diviene sempre più necessaria la disposizione di test di laboratorio che possano restituire un’accurata fotografia della diffusione nella popolazione del virus SARSCoV2.

In un momento di emergenza come quello che stiamo vivendo, lo strumento più idoneo è l’esame sierologico quantitativo per la ricerca degli anticorpi anti-SARS-CoV-2. I test immunologici rilevano gli anticorpi prodotti dall’organismo in risposta all’infezione di un patogeno e, inevitabilmente, devono far fronte alla variabilità intrinseca della risposta anticorpale umana, che richiede tempo per essere caratterizzata. Proprio per questo motivo, è in atto una discussione attorno ai test rapidi (test qualitativi).

Invece il test ELISA, validato direttamente dallo Spallanzani di Roma e disponibile dalla fine di Aprile, è stato fornito alla Regione Toscana e costituirà un utile complemento alla diagnosi molecolare soprattutto nel caso di soggetti asintomatici, consentendo di eseguire studi epidemiologici sulla diffusione del virus. Una finalità importante, dal momento che è ormai noto che una rapida identificazione dei soggetti infetti è il primo passo per l’attuazione di misure che controllino l’ulteriore diffusione del virus tra la popolazione.

Un esempio specifico dell'applicazione del metodo ELISA sandwich è nei test di gravidanza, dove viene utilizzato per rilevare la presenza dell'ormone gonadotropina corionica umana (hCG) nelle urine o nel sangue.

Preparazione all'Esame ELISA: Cosa Aspettarsi

La preparazione all'esame ELISA è generalmente semplice. Nella maggior parte dei casi, non è necessario essere a digiuno. Tuttavia, è importante seguire le istruzioni specifiche fornite dal medico o dal laboratorio. Informare il medico di eventuali farmaci che si stanno assumendo, in quanto alcuni farmaci potrebbero interferire con i risultati del test.

Il Prelievo di Sangue

L'esame ELISA richiede un semplice prelievo di sangue venoso, solitamente dal braccio. L'infermiere o il tecnico di laboratorio disinfetterà la zona del prelievo e inserirà un ago in una vena. Il sangue verrà raccolto in una provetta e inviato al laboratorio per l'analisi. Il prelievo di sangue è generalmente rapido e indolore, anche se alcune persone possono avvertire un leggero fastidio o un piccolo livido nella zona del prelievo.

Interpretazione dei Risultati dell'Esame ELISA

L'interpretazione dei risultati dell'esame ELISA deve essere effettuata da un medico o da un professionista sanitario qualificato. I risultati sono solitamente espressi come valori numerici, che rappresentano la quantità di antigene o anticorpo presente nel campione. Questi valori vengono confrontati con un valore di riferimento (cut-off) stabilito dal laboratorio. Un risultato al di sopra del cut-off è considerato positivo, indicando la presenza dell'analita bersaglio, mentre un risultato al di sotto del cut-off è considerato negativo. Tuttavia, è importante considerare che un risultato positivo non sempre indica una malattia attiva, e un risultato negativo non sempre esclude la presenza di una patologia. Il medico valuterà i risultati dell'ELISA nel contesto clinico del paziente, tenendo conto dei sintomi, della storia medica e di altri esami diagnostici.

• Il punto di cut-off per ciascun test ELISA può essere diverso ed è preimpostato dal produttore in base alla sensibilità e specificità desiderate.
• Per gli ELISAs diretta, indiretta o sandwich, qualsiasi numero maggiore del punto di cutoff è considerato positivo. Per un ELISA competitiva, qualsiasi numero maggiore del punto di cutoff è considerato negativo.

Falsi Positivi e Falsi Negativi

Come tutti i test diagnostici, l'ELISA può occasionalmente produrre risultati falsi positivi o falsi negativi. Un risultato falso positivo indica la presenza dell'analita bersaglio quando in realtà non è presente, mentre un risultato falso negativo indica l'assenza dell'analita bersaglio quando in realtà è presente. Le cause di falsi positivi e falsi negativi possono essere diverse, tra cui:

• Reazioni crociate: Anticorpi che si legano a sostanze simili all'analita bersaglio.
• Problemi tecnici: Errori durante l'esecuzione del test.
• Fase precoce dell'infezione: Il sistema immunitario potrebbe non aver ancora prodotto anticorpi rilevabili.
• Immunodeficienza: Il sistema immunitario potrebbe non essere in grado di produrre una quantità sufficiente di anticorpi.

Per questo motivo, è importante confermare i risultati dell'ELISA con altri test diagnostici, soprattutto in caso di risultati dubbi o discordanti con il quadro clinico del paziente.

Vantaggi e Limiti dell'Esame ELISA

L'esame ELISA presenta numerosi vantaggi, tra cui:

• Elevata sensibilità: È in grado di rilevare anche piccole quantità di analita bersaglio.
• Elevata specificità: Utilizza anticorpi specifici per l'analita bersaglio, riducendo il rischio di reazioni crociate.
• Versatilità: Può essere utilizzato per rilevare una vasta gamma di analiti in diversi campioni biologici.
• Costo relativamente basso: Rispetto ad altre tecniche di analisi immunologica, l'ELISA è generalmente più economico.
• Facilità di esecuzione: Può essere eseguito in modo automatizzato, consentendo l'analisi di un gran numero di campioni in tempi brevi.

Tuttavia, l'esame ELISA presenta anche alcuni limiti, tra cui:

• Possibilità di falsi positivi e falsi negativi: Come discusso in precedenza.
• Sensibilità alla variabilità: I risultati possono essere influenzati da diversi fattori, come la temperatura, l'umidità e la qualità dei reagenti.
• Necessità di personale qualificato: L'esecuzione e l'interpretazione dei risultati richiedono personale di laboratorio esperto.

Vantaggi e limitazioni del saggio ELISAL

L’analisi ELISA è ormai fortemente consolidata tra le tecniche di laboratorio ma non è certo infallibile. Il vantaggio principale è l’alta sensibilità e specificità diagnostica: si usa per quantificare molecole contenute in vari campioni, compresi siero, plasma, urina, saliva o estratti di tessuto. Attraverso ELISA test, però, sono ottenibili soltanto informazioni riguardanti la presenza o meno di determinate molecole nel nostro campione: questo è uno svantaggio notevole, soprattutto quando si vuole analizzare e caratterizzare biochimicamente ciò che il saggio ha rilevato.

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